Cambiamenti del proteoma dei fibroblasti e delle cellule endoteliali dopo incubazione con corpi densi subvirali del citomegalovirus umano
Dati scientifici volume 10, numero articolo: 517 (2023) Citare questo articolo
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Il citomegalovirus umano (HCMV) è un patogeno di elevata rilevanza medica. I corpi densi subvirali (DB) sono stati sviluppati come candidati vaccini per alleviare le gravi conseguenze dell'infezione da HCMV. Lo sviluppo di un vaccino candidato per l'applicazione sull'uomo richiede una conoscenza dettagliata della sua interazione con l'ospite. È stata eseguita un'analisi completa basata sulla spettrometria di massa (MS) riguardo ai cambiamenti nel proteoma delle cellule in coltura cellulare, esposte a DB.
Il citomegalovirus umano (HCMV) è un β-herpesvirus e la principale causa di infezioni congenite in tutto il mondo, che provocano una serie di conseguenze come perdita dell'udito, deficit visivi o disturbi cognitivi1. Nel contesto dell’immunosoppressione sistemica, l’infezione da HCMV può provocare morbilità e mortalità sostanziali1. I fibroblasti infettati da HCMV rilasciano elevate quantità di particelle non infettive, chiamate corpi densi, nel surnatante della coltura cellulare2,3. Le analisi di spettrometria di massa dei DB isolati hanno contribuito a chiarire la loro composizione proteica e hanno rivelato la presenza di importanti antigeni della risposta immunitaria adattativa contro HCMV4,5. Nel frattempo, esperimenti in vitro e studi su animali hanno dimostrato che i DB sono notevolmente immunogenici e inducono una robusta risposta all'interferone (IFN)6,7,8,9,10,11. Di conseguenza, il DB è stato considerato un vaccino promettente contro l'HCMV12,13. Per quanto riguarda l’applicazione umana di un candidato vaccino negli studi clinici e per la concessione della licenza finale, una conoscenza completa dell’impatto del vaccino sulle cellule ospiti è importante per valutare i potenziali effetti avversi e la tollerabilità. I set di dati sull'impatto del DB sui fibroblasti in coltura e sulle cellule endoteliali sono stati generati utilizzando la spettrometria di massa (MS). Questi set di dati sono stati utilizzati in una precedente pubblicazione incentrata sullo studio della risposta dell'interferone-β e sull'induzione dell'espressione del gene stimolato dall'interferone (ISG) nei fibroblasti e nelle cellule endoteliali in seguito all'esposizione al DB11.
I fibroblasti primari del prepuzio umano (HFF) sono stati ottenuti dal prepuzio di un neonato nel 1994 e in passato sono stati utilizzati per la ricerca6,7,14,15,16. L'approvazione per l'utilizzo di queste cellule per gli studi è stata ottenuta dal comitato etico del consiglio medico della Renania-Palatinato, Germania. Gli HFF sono stati mantenuti in un mezzo essenziale minimo (MEM; Gibco-BRL, Glasgow, Scozia) integrato con siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100 mg/l di L-glutammina, 0,5 ng/ml di fattore basico di crescita dei fibroblasti (bFGF, Invitrogen, Karlsruhe, Germania) e gentamicina (5 mg/l). Per gli esperimenti sono stati utilizzati numeri di passaggi cellulari HFF compresi tra 16 e 19. Le cellule HEC-LTT sono state create da Dagmar Wirth e colleghi17. Le cellule sono state derivate da cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) che sono state condizionatamente immortalate con espressione tetraciclina-dipendente dell'antigene T grande SV40 e della trascrittasi inversa della telomerasi umana (hTERT). Per la coltivazione, i recipienti di coltura sono stati rivestiti con gelatina allo 0,1% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;) per almeno 30 minuti. Le cellule HEC-LTT sono state mantenute nel mezzo di crescita endoteliale (EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd., Basilea, Svizzera) integrato con 2 μg/mL di doxiciclina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). La proliferazione delle cellule HEC-LTT può essere controllata dalla doxiciclina (DOX). L'aggiunta di DOX attiva l'espressione delle proteine immortalizzanti hTERT e dell'antigene T grande SV40, con conseguente proliferazione cellulare. La doxiciclina è stata omessa durante l'intero esperimento. Il permesso di utilizzare le cellule HEC-LTT per scopi di ricerca è stato concesso tramite un accordo di trasferimento di materiale dal Centro Helmholtz per la ricerca sulle infezioni (HZI). Le cellule hanno dimostrato di essere permissive all'infezione da HCMV18. Gli HEC-LTT ci sono stati gentilmente inviati da Christian Sinzger (Istituto di virologia, Centro medico universitario di Ulm, Ulm, Germania) e utilizzati per gli esperimenti dal passaggio 41 al passaggio 55.