Sviluppo dell'acido nucleico peptidico

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12482 (2023) Citare questo articolo

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Numerosi nuovi metodi per rilevare agenti patogeni di origine alimentare sono stati ampiamente sviluppati per garantire la sicurezza alimentare. Tra gli importanti batteri di origine alimentare, il Bacillus cereus è stato identificato come un patogeno preoccupante che causa varie malattie alimentari, suscitando interesse nello sviluppo di metodi di rilevamento efficaci per questo patogeno. Sebbene sia disponibile un metodo standard basato sulla coltura e sul test di conferma biochimico, è dispendioso in termini di tempo e manodopera. Sono stati sviluppati metodi alternativi basati sulla PCR, ma mancano di capacità ad alto rendimento e facilità d'uso. Questo studio, pertanto, tenta di sviluppare un metodo robusto per il rilevamento di B. cereus sfruttando gli acidi nucleici peptidici pirrolidinilici (PNA) altamente specifici come sonde per un metodo di array di sfere con capacità multiplex e ad alta produttività. In questo studio, i PNA recanti la spina dorsale dell'acido prolil-2-amminociclopentancarbossilico (ACPC) con sequenze di rRNA groEL, motB e 16S sono stati accoppiati in modo covalente con tre set di perline con codice a barre fluorescente per rilevare i tre geni di B. cereus. La matrice di sfere sviluppata basata su acpcPNA ha mostrato una buona selettività in cui erano rilevabili solo segnali in presenza di B. cereus, ma non per altre specie. La sensibilità di questo test con microsfere basato su acpcPNA nel rilevamento del DNA genomico è risultata pari a 0,038, 0,183 e 0,179 ng per groEL, motB e 16S rRNA, rispettivamente. Questa prestazione è stata chiaramente superiore alla sua controparte DNA, confermando quindi una forza legante molto più forte di acpcPNA rispetto al DNA. La robustezza del metodo sviluppato è stata ulteriormente dimostrata testando il latte arricchito artificialmente e la senape sottaceto con un'interferenza minima da parte dei parametri alimentari. Pertanto, questo metodo proof-of-concept basato su acpcPNA ha dimostrato di fungere da efficace metodo alternativo basato sugli acidi nucleici per i patogeni di origine alimentare.

Il Bacillus cereus è uno dei principali agenti patogeni di origine alimentare che può essere trovato in un'ampia gamma di prodotti alimentari che vanno dagli alimenti pronti, agli alimenti fermentati e ai latticini1. A causa della sua tolleranza a pH e temperature estremi, B. cereus è stato comunemente riscontrato in varie fasi della lavorazione alimentare2, provocando gravi epidemie di origine alimentare in tutto il mondo con una prevalenza complessiva pari al 23,746%. In Europa è la seconda causa di epidemia di origine alimentare dopo lo Staphylococcus aureus3. Negli Stati Uniti, circa 63.000 persone/anno si sono ammalate con un tasso di ospedalizzazione dello 0,4% del gruppo Bacillus4.

Metodi rapidi e accurati che consentono il monitoraggio e il rilevamento tempestivo di B. cereus negli alimenti possono fungere da metodo di mitigazione chiave per ridurre i suoi focolai. Inoltre, dato che non tutte le specie di Bacillus sono patogene, è imperativo poterle identificare a livello delle specie Bacillus5. Sebbene sia disponibile un metodo standard ISO 7932:2004 basato su un protocollo di conteggio su piastra di agar6, questo metodo richiede tempo e manodopera (richiede un periodo di incubazione fino a 24 ore a 30 °C con ulteriori 2–7 giorni per la conferma analisi) e richiede professionisti qualificati. Per identificare B. cereus7,8 sono stati sviluppati metodi molecolari alternativi come le tecniche basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR). Tuttavia, la maggior parte di questi metodi basati sulla PCR si basano su metodi di elettroforesi su gel a bassa risoluzione per visualizzare i prodotti della PCR, rendendoli difficili per l'interpretazione dei risultati. Molte tecniche avanzate basate sulla PCR, come la PCR quantitativa (qPCR) e la PCR multiplex, sono state quindi sviluppate per superare queste limitazioni9,10,11, ma la loro capacità multiplex è ancora limitata a causa delle complicazioni derivanti dalla formazione di dimeri di primer12. Inoltre, la maggior parte dei metodi basati sulla PCR dipendono dal DNA come sonda specifica, che può essere degradata da fattori ambientali, come temperatura, pH ed enzimi.

Per superare queste limitazioni, questo studio presenta un metodo di rilevamento per B. cereus combinando i vantaggi della capacità multiplex e della facilità di acquisizione dei risultati dalla tecnica dell'array di sfere e dell'acido peptidico nucleico (PNA) altamente specifico come sonda alternativa. La piattaforma di array di sfere utilizzata in questo studio si basa su una tecnologia xMAP ad alta produttività, sensibile e multiplex per diversi tipi di target13,14. Questo metodo utilizza perline paramagnetiche con codice a barre fluorescente funzionalizzate con gruppi carbossilici per l'attacco covalente di ligandi nucleofili. Ciascun set di sfere può essere identificato da un laser rosso e il segnale viene misurato da un reporter fluorescente (R-ficoeritrina) da un laser verde13,15,16. Rispetto alle tradizionali tecniche di DNA microarray, la tecnologia bead array offre numerosi vantaggi. Innanzitutto, la produttività di questa tecnica è chiaramente maggiore. Questo perché è considerata semi-automatica, mentre la tecnologia del DNA microarray non lo è. In secondo luogo, grazie alla fase di lavaggio automatico, la tecnologia degli array di sfere solitamente presenta un fondo inferiore e una consistenza più elevata rispetto alla tecnologia dei microarray di DNA17. Infine, il costo di un rilevatore con tecnologia bead array è molto più economico di quello del microarray di DNA, rendendolo quindi più pratico. Pertanto, vari sistemi di array di sfere basati sul DNA sono stati applicati con successo per rilevare un'ampia varietà di contaminazioni alimentari come allergeni alimentari18, agenti patogeni di origine alimentare nella carne di pollo19 e quattro agenti patogeni di origine alimentare tra cui Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus e Shigella. spp. nei latticini20. È interessante notare che il metodo riportato per il rilevamento di B. cereus richiedeva una temperatura elevata a 38 °C per ottenere un segnale rilevabile, probabilmente a causa della minore stabilità del legame DNA-DNA rispetto al legame PNA-DNA. Ciò lo rende poco pratico per l’effettiva lavorazione industriale20. Inoltre, tutti questi metodi di array di sfere riportati utilizzavano il DNA come sonda specifica, la cui specificità dipende in modo significativo dalla temperatura di ibridazione e dalla lunghezza delle sonde21. Abbiamo ipotizzato che l'uso di imitatori alternativi dell'acido nucleico con una migliore affinità di legame con il bersaglio del DNA possa migliorare le prestazioni complessive di rilevamento.