Sviluppo di una biobanca di Plasmodium vivax per saggi funzionali ex vivo

Malaria Journal volume 22, numero articolo: 250 (2023) Citare questo articolo

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Il Plasmodium vivax è la seconda causa più diffusa di malaria, ma rimane difficile da studiare a causa della mancanza di un sistema di coltura in vitro continuo, evidenziando la necessità di istituire una biobanca di isolati clinici con più congelamenti per campione da utilizzare nei test funzionali. Sono stati confrontati diversi metodi per crioconservare gli isolati di parassiti e successivamente è stato convalidato quello più promettente. L'arricchimento dei parassiti allo stadio iniziale e avanzato e la maturazione dei parassiti sono stati quantificati per facilitare la pianificazione del test.

Per confrontare i protocolli di crioconservazione, nove isolati clinici di P. vivax sono stati congelati con quattro miscele a base di glicerolita. Il recupero del parassita dopo lo scongelamento, dopo l'arricchimento con KCl-Percoll e nella coltura in vitro a breve termine è stato misurato tramite microscopia su vetrino. È stato misurato l'arricchimento dei parassiti in stadio avanzato mediante selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). È stata confrontata anche la conservazione a breve e lungo termine dei parassiti a -80 °C o in azoto liquido.

Delle quattro miscele di crioconservazione, una miscela (glicerolita:siero:RBC in un rapporto 2,5:1,5:1) ha prodotto un migliore recupero dei parassiti e un miglioramento statisticamente significativo (P < 0,05) nella sopravvivenza dei parassiti nella coltura in vitro a breve termine. Utilizzando questo protocollo è stata successivamente generata una biobanca di parassiti che ha prodotto una raccolta di 106 isolati clinici, ciascuno con 8 fiale. La qualità della biobanca è stata validata misurando diversi fattori provenienti da 47 disgeli: la riduzione media della parassitemia post-disgelo (25,3%); l'arricchimento medio dopo KCl-Percoll (6,65 volte); e la percentuale media di recupero dei parassiti (22,0%, misurata su 30 isolati). Durante la coltura in vitro a breve termine, è stata osservata una maturazione robusta dei parassiti dallo stadio ad anello agli stadi successivi (> 20% di trofozoiti, schizonti e gametociti) nel 60,0% degli isolati entro 48 ore. L'arricchimento degli stadi maturi del parassita tramite MACS ha mostrato una buona riproducibilità, con una media del 30,0% di parassitemia post-MACS e una media di 5,30 × 105 parassiti/fiala. Infine, è stato testato l’effetto della temperatura di conservazione e non è stato osservato alcun impatto significativo derivante dalla conservazione a breve termine (7 giorni) o a lungo termine (7-10 anni) a -80 °C sul recupero, arricchimento o vitalità dei parassiti.

Qui, viene dimostrato un metodo di congelamento ottimizzato per gli isolati clinici di P. vivax come modello per la generazione e la validazione di una biobanca di parassiti da utilizzare in test funzionali.

Il Plasmodium vivax è la specie parassitaria della malaria più diffusa geograficamente ed è responsabile del secondo maggior numero di casi di malaria a livello globale. Sebbene l’incidenza totale di P. vivax sia diminuita a livello globale da 20,5 milioni di casi nel 2000 a 4,9 milioni di casi nel 2021 [1], permangono ostacoli significativi negli sforzi per eradicare questo patogeno, inclusa la mancanza di un vaccino contro P. vivax e la crescente resistenza a P. vivax. farmaci antimalarici.

La ricerca sulla biologia fondamentale di P. vivax è stata fortemente limitata a causa della mancanza di un sistema di coltura continua in vitro [2,3,4]. Questa mancanza di coltura continua richiede l'uso di isolati clinici di P. vivax per indagini sperimentali e l'accesso limitato a questi isolati ha ostacolato il progresso nella conoscenza di questo parassita. Recentemente, sono stati stabiliti approcci di coltura in vitro a breve termine per P. vivax (incluso in alcuni casi l'uso di isolati crioconservati) [3, 5, 6], rendendo possibile l'esecuzione di test di resistenza ai farmaci a ciclo singolo [3, 7] nonché test di invasione per valutare il tropismo dei reticolociti dell'ospite [8], gli effetti degli anticorpi inibitori dell'invasione [9,10,11,12,13,14,15,16] e dei mutanti del recettore dell'ospite [17, 18]. Vi è un crescente riconoscimento dell’importanza della biobanca dei campioni di malattie infettive [19,20,21], incluso il Plasmodium falciparum [22,23,24]. La generazione di una biobanca di isolati di P. vivax crioconservati che possano essere scongelati in modo affidabile per la sperimentazione a valle (saggi funzionali, test di espressione genica, genomica) sarebbe una risorsa fondamentale per ulteriori progressi nel campo [4].

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>

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